PCR-DNA實驗注意事項

    1．加樣方面（混勻，不要有氣泡，管壁上不要有液體）
    2．試劑方面（冷凍，不宜反復凍融超過3次；可分裝）
    3．使用非肝素鈉抗凝劑采血管
    4．實驗室方面（實驗做完注意通風、84清理臺面、紫外線殺菌）
    5．注意污染（平常配試劑管蓋的放置不要污染、加樣時指甲及手套不要碰到管內(nèi)壁）
 

    實驗操作步驟
    1.室溫融解；
    2.取血清（或標準品）50ul加入50ul核酸提取液先震蕩混勻10秒然后6000轉(zhuǎn)瞬間離心一下（等離心機轉(zhuǎn)速到了接近6000按停止）99度水煮或干浴10分鐘，稍微彈碎；然后13000轉(zhuǎn)離心10分鐘保留上清液備用
    3.配混合液
    取N*36ul混合液+N*0.4ulTAQ酶混勻（先震蕩混勻10秒然后6000轉(zhuǎn)瞬間離心）（N為管數(shù)，實際上我們要取N+1因為加樣管壁上會沾液不多配會導致zui后一個有誤差例如有10個樣本則取11*36+11*0.4；）
    4.取上述混合液36.5ul分別加入pcr反應管不要有氣泡管壁不要有水珠
    5.加樣取4ul上清液加入pcr管加樣槍在液體里面反復打個7~8下zui后在離心機稍微離一下6000轉(zhuǎn)瞬間離心6.上機反應檢查管壁水珠氣泡
 

    實驗結(jié)果方面
    1.標準曲線相關系數(shù)至少為-0.99越小越好
    2.根據(jù)曲線分析結(jié)果（曲線是否穩(wěn)，無波浪）38循環(huán)曲線抬頭為陰性
    實線抬頭曲線不抬頭為YMDD變異（實線---病毒量虛線---判斷有無變異）
    21個循環(huán)值大概為7次方后面加3.5個循環(huán)減少一個次方即24.5左右為6次方......
 

    友情提示：上述操作不一定全正確，請自行參考各試劑廠試劑說明書以及檢驗方面相關資料。